Визначення вітаміну В12 в сироватці способом ізотопного розбавлення покритими частинками вугілля — методика, показники норми


Гематологія / Среда, Март 27th, 2019

Принцип визначення вітаміну В12 в сироватці частинками вугілля . Сироватковий вітамін В12 (пов’язаний з білками) вивільнити шляхом підкислення і зігрівання, потім перемішати з певною кількістю радіоактивного вітаміну В12; додати властивий фактор (ПФ) (меншою що зв’язує сили, ніж додаткову кількість радіоактивного вітаміну В12), надлишок незв’язаного з ПФ вітаміну В12 усунути з покритими білками частинками вугілля; радіоактивність надосадочной маси (содержащеай радіоактівнихй і нерадіоактивні вітамін В12, пов’язаний з ПФ) зіставити з такою у позбавленої сироватки проби (містить лише радіоактивний вітамін В12), при цьому кількість вітаміну В12 в сироватці отримаємо за допомогою простого рівняння (Lau, Gottlieb, Wasserman і Herbert ).

Матеріали визначення вітаміну В12 в сироватці частинками вугілля

Приготувати Вугілля , покритий білком перемішавши однакові обсяги 5% рідкої суспензії рослинного вугілля ( «Norit А» фармацевтичної ступеня) і 1% розчину коров’ячого серумальбуміна (з усуненням надосадочной маси і приведенням до вихідного обсягу). Можна зберігати місяць при температурі + 5 ° С або невизначений термін — в лиофилизированном стані.

Переважно Використовувати вугілля , обгорнуті в гемоглобін. Гб приготувати з еритроцитів людини, тричі промитих, 0,9% розчином NaCl, потім гемолізованих в однаковому обсязі дистильованої води з додаванням толуолу (0,5 обсягу); хороша збовтати 5 хвилин, процентріфугіровать 15 хвилин при 3000 об. / хв., видалити шар толуолу і еритроцитної детрит, нижній шар пропустити через фільтрувальну папір ватман № 1. Фільтрат гемоглобіну (прозорий) виміряти звичайним способом і, за допомогою дистильованої води, довести до концентрації 10 г / 100 мл. Застосовувати частина Гб на 20 частин рослинного вугілля (розрахунок відповідно вазі).

Розчин властивого фактора . Рекомендується «National Formulary Intrinsic Factor (NFIF), з якого готується розчин-запас з розрахунку 100 мг ПФ на 100 мл 0,9% розчину NaCl (зберігається при температурі -20 ° С більше року). Розведенням 1: 100 з розчину-запас готується робочий розчин (10 мкг ПФ / мл, связивающіей здатністю приблизно 800 пг вітаміну В12 / мл), який можна зберігати деякий час в рефрижераторі. Замість «NFIF» можна використовувати шлунковий сік (в запасі) людини в нормі, після видалення пепсину.

Стандартний цианкобаламин . Розвести в дистильованої воді до концентрації 1000 пг / мл.

Радіоактивний цианкобаламин (СО57В12) специфічної активності приблизно 11 uCi / Uг. Розвести в дистильованої воді до концентрації 1000 пг / мл; можна зберігати три місяці при температурі + 5 ° С. При кожному визначенні проводити стандартизацію робочого розчину (1000 пг / мл) СО57В12 в порівнянні з відповідним «холодним» розчином вітаміну В12.

При Перемішуванні 0,5 мл з кожного розчину виявимо скорочення точно на 50% пов’язаної з ПФ радіоактивності (пробірка № 3 в описаному нижче способі); більше скорочення свідчить про меншу концентрації розчину Со57В12 і навпаки. Для розрахунку фактичної кількості Со57В12 використовувати формулу:

ПгСо57В12 = пг «холодного» В12 х Б ‘/ (Б — Б’) , де: Б = число сцінтіляцій в хв. в пробірці з Со57 В12 + ПФ (№ 3), в той час як Б ‘являє собою число сцінтіляцій в хвилину, в пробірці, в якій перший елемент замінений сумішшю Со57 В12 і «холодного» В12, в однакових частинах, причому в обох випадках ввести поправку обчисленням радіоактивності треба-садочної маси.

Соляна кислота: розчин 0,25 Н.

Техніка визначення визначення вітаміну В12 в сироватці частинками вугілля

Визначення з сироватки (також з плазми, за умови, щоб відбір робили іншим шляхом, ніж на гепарині). Використовувану скляний посуд ретельно вичистити, щоб уникнути будь-якого занесення В12.

Визначення Проводити (в подвійному екземплярі) в пробірках на 10 мл, що містять чотири різні комбінації реагентів, при цьому кількість (в мл) і послідовність прийомів приведені в таблиці.

Визначення вітаміну В12 в сироватці способом ізотопного розбавлення покритими частинками вугілля - методика, показники норми

У пробірках 2 і 4 знаходяться контрольні Проби надосадової маси , в яких має бути не більше 1% доданої реактивності; пробірка № 3 містить контрольну пробу ПФ, з якої випливає зв’язує здатність ПФ: 5 мкг / 0,5 мл розчину.

Розрахунок результату . Відняти радіоактивність (= числу сцінтіляцій в хвилину) контрольних проб надосадочной маси (2 і 4) із значень, отриманих від проб 1 і 3. Виправлені таким чином значення дадуть сироваткову концентрацію вітаміну В12, по формулі:

Пг В12 / мл сироватки — 2 х пгСо57В12 х (Б / б’-1) ,
Де: Б являє собою число сцінтіляцій / хв. (з поправкою) в пробірці № 3, в той час як Б ‘- число сцінтіляцій / хв. в пробірці № 1.

Тлумачення визначення вітаміну В12 в сироватці частинками вугілля . Отримані цим методом результати близькі до отримуваних по мікробіологічному тесту з Euglena Gracillis, і навіть чутливіші останнього для діапазону значень менше 100 пг / мл.

Нормальні значення коливаються від 200 до 900 пг / мл сироватки . Явно заниженими розглядаються значення менше 100 пг / мл, а розташовані між 100 і 150 пг / мл — показові щодо дефіциту вітаміну В12.

Для більшої Точності в діапазоні значень менше 200 пг / мл можна використовувати більшу кількість сироватки або скоротити (при відповідному скороченні кількості ПФ) кількість доданого Со57В12 на 100 пг; і навпаки, для значень більше 1500 пг / мл можна зменшити кількість сироватки або збільшити кількість Со57В12 і ПФ. Однак для потреб клінічного діагнозу такі заходи не потрібні.

Визначення вітаміну В12 в еритроцитах

Визначення вітаміну В12 в еритроцитах (після попереднього екстрагування з еритроцитів) проводити за досить схожою техніці (Kelly і Herbert); нормальні значення: 150-250 (100-300) пг / мл. Може краще відобразити положення запасів В12, зокрема при «штучно» підвищеному сироватковому рівні. Однаковий технічний принцип застосований для визначення активності ПФ і дослідження анти-ПФ антитіл в шлунковому соку і сироватці Gottlieb і співр.).

Визначення за допомогою Розбавлення радіоактивними ізотопами можна застосовувати і хворим, які знаходяться на лікуванні антибіотиками.